Ý nghĩa thực tiễn
Các ứng dụng của kỹ thuật PCR trong nhiều lĩnh vực đã và đang tạo ra những kết quả kỳ diệu, giúp các nghiên cứu sinh học phân tử trở nên nhẹ nhàng và dễ dàng hơn nhiều lần so với trước kia. Nếu trước đây, một thử nghiệm sinh học phân tử phải kéo dài hàng tuần, thậm chí hàng tháng, thì nay chỉ mất vài ngày; thậm chí, trước đây có những thí nghiệm không thể thực hiện được, thì ngày nay là hoàn toàn có thể, với PCR.
Nhờ PCR, sinh học phân tử ngày nay đã có những bước tiến nhảy vọt trong mọi lĩnh vực, tạo ra cuộc đại cách mạng trong sinh học phân tử.
Quy trình và phương pháp thực hiện
Điều kiện ứng dụng
Để triển khai kĩ thuật PCR, cần có những đầu tư cơ bản ban đầu về trang thiết bị, phòng thí nghiệm và đội ngũ nhân lực có kinh nghiệm trong lĩnh vực sinh học phân tử.
Trang thiết bị gồm: máy PCR Mastercycler X50s, máy đọc kết quả điện di, máy ủ nhiệt Thermomixer F1.5, Micropipette Research plus, tủ thao tác PCR UVP, máy điện di Mupid exu, tủ lạnh và tủ âm sâu Eppendorf, máy vortex, tủ an toàn sinh học.
Phòng thí nghiệm tiêu chuẩn bao gồm 6 phòng riêng biệt, được thiết kế hoạt động theo một chiều để tránh nhiễm chéo từ sản phẩm sau khuếch đại, gồm: phòng chuẩn bị mẫu, phòng tách chiết DNA, phòng chuẩn bị phản ứng PCR, phòng đọc kết quả.
Phòng thí nghiệm PCR tiêu chuẩn
Nguyên lý thực hiện
PCR là quá trình khuếch đại đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzyme DNA polymerase. Sự khuếch đại này được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (có thể đến 30-40 lần) gồm 3 giai đoạn: biến tính DNA (khoảng 950C), bắt cặp mồi (37-650C) và kéo dài DNA (khoảng 720C).
Nhờ vậy, từ một đoạn DNA mạch đôi, sau một chu kỳ phản ứng, được nhân thành hai mạch đôi DNA và có thể thực hiện chu trình khuếch đại mới (2 thành 4, 4 thành 8 theo cấp số nhân với công bội là 2 theo lý thuyết).
Giai đoạn 1 (biến tính DNA, denaturation): được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94–950C) trong vòng 0,5-1,0 phút để tách phân tử DNA mạch kép thành hai mạch đơn. Chính hai mạch đơn này sẽ là mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Giai đoạn 2 (bắt cặp mồi, annealing): nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn. Trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong khoảng 55–650C. Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30–60 giây.
Giai đoạn 3 (kéo dài DNA, elongation – extension): nhiệt độ được tăng lên 720c giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất. Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:
Tổng lượng DNA khuếch đại = mx2n.
Trong đó, m là số bản sao của chuỗi mã hóa; n là số chu kỳ.
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân thành hai bản sao, và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30-40 lần thì từ một DNA đích đã nhân được thành 230-240 bản sao (tức là đến hàng tỷ bản sao).
Quy trình thực hiện PCR:
Gồm 5 bước cơ bản:
Bước 1: tách chiết DNA từ mẫu máu bệnh nhân, mẫu mô, mẫu thực vật, mẫu thực phẩm,…
Bước 2: chuẩn bị phản ứng PCR và thực hiện trong ống PCR (Eppendorf) với thành phần gồm primer, DNA Polymerase (New England Biolabs), dung dịch đệm, DNA khuôn, MgCl2.
Bước 3: thực hiện phản ứng PCR trên hệ thống máy PCR Mastercycler X50s - Eppendorf
Bước 4: thực hiện điện di trên bộ điện di ngang
Bước 5: đọc kết quả trên hệ thống chụp ảnh gel điện di ImageQuant Las 500
Ưu điểm công nghệ. Hiệu quả kinh tế
Ưu điểm
- Dễ dàng phân tích kết quả.
- Kĩ thuật đơn giản dễ dàng chuyển giao trong thời gian ngắn.
- Khả năng phát hiện nhiều gene trong cùng 1 phản ứng mạnh mẽ.
- Thời gian phản hồi kết quả nhanh.
Hiệu quả kinh tế
- Chi phí đầu tư ban đầu ở mức vừa phải: chi phí cho 01 máy PCR dao động từ 3.000–5.000 USD, sử dụng các mồi rẻ (khoảng 12 USD/mồi), 1 phản ứng 5-plex chỉ tốn 120 USD. Trong khi đó, nếu sử dụng Real-time PCR kết hợp với các loại mẫu dò huỳnh quang thì chi phí ban đầu khá cao, khoảng 200 USD/mẫu dò. Nếu muốn phát hiện nhiều gene trong cùng 1 phản ứng (làm multiplex), thì chi phí bỏ ra ban đầu cho Real-time PCR rất cao (hơn 1.200 USD cho 4-plex hoặc 1.500 USD cho 5-plex).
- Chi phí sử dụng thấp hơn so với các kĩ thuật tương đương.
- Có thể triển khai tại các phòng thí nghiệm trung bình.
Thông tin liên hệ chuyên gia, hỗ trợ
Công ty BCE Việt Nam
Địa chỉ : tầng 12, tòa nhà Sông Đà, Số 14B Kỳ Đồng, phường 9, quận 3, TP.HCM.
Nguời liên hệ : Bà Phan Lâm Ái Phương – Chuyên gia ứng dụng
Điện thoại : 0942 433 529
Email: phuongpla@bcevietnam.com.vn
Website : www.bcevietnam.com.vn.